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www.色情帝国2017.com报道杨辉等开发高精度单碱基基因编辑工具,全面降低RNA脱靶风险_www.色情帝国2017.com官网资讯

文章来源: iNature       发布时间:2019-06-11

2019年6月10日,中科院神经科学研究所杨辉、周海波,与四川大学郭帆和中科院上海营养所李亦学共同通讯在Nature在线发表题为“Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis”的研究论文,该研究进一步验证了BE3与ABE两种DNA单碱基编辑器在RNA水平上的脱靶现象,提出了针对这两种系统的优化方案,有效降低了它们在RNA水平上的脱靶效应。


1、单碱基编辑技术脱靶现象的验证及优化


 杨辉等开发高精度单碱基基因编辑工具,全面降低RNA脱靶风险


最近开发的DNA碱基编辑方法能够在基因组DNA中直接产生所需的点突变而不产生任何双链断裂(DSB),但是脱靶编辑的问题限制了这些方法的应用。虽然先前的几项研究已经评估了基因组DNA中的脱靶突变,但现在认识到常用的DNA碱基编辑器中的脱氨酶通常表现出RNA结合活性。例如,发现胞嘧啶碱基编辑器(CBE)中使用的胞嘧啶脱氨酶APOBEC1靶向DNA和RNA,并且发现腺嘌呤碱基编辑器(ABE)中使用的腺嘌呤脱氨酶TadA诱导RNA上的位点特异性肌苷形成。


然而,尚未评估由DNA碱基编辑引起的任何潜在的RNA突变。腺相关病毒是DNA编辑基因疗法最常用的传递系统;这些病毒可以在体内维持长期基因表达,因此DNA基因编辑诱导的潜在RNA突变的程度非常值得关注。


 杨辉等开发高精度单碱基基因编辑工具,全面降低RNA脱靶风险

共同通讯作者郭帆教授(左)与杨辉研究员(右)


在这里,研究人员定量评估了由CBEs和ABEs诱导的RNA单核苷酸变异(SNV)。研究人员发现胞嘧啶碱基编辑器BE3和腺嘌呤碱基编辑器ABE7.10都产生了数万个脱靶RNA SNV。随后,通过工程化脱氨酶,研究人员发现三种CBE变体和一种ABE变体将脱靶RNA SNV降低至基线,同时保持其有效的DNA靶向活性。该研究揭示了DNA编辑中脱靶效应的先前被忽视的方面,并且还证明通过工程脱氨酶可以消除这种效应。值得注意的是,目前的优化方案都不能解决BE3单碱基编辑系统对基因组DNA 上产生的sgRNA序列非依赖性脱靶问题,需要进一步探索新的优化方案解决这一问题。


2、杨辉/李亦学/Lars M. Steinmetz等团队建立新型脱靶检测技术,基因编辑工具安全性评估或迎来新突破


 杨辉等开发高精度单碱基基因编辑工具,全面降低RNA脱靶风险


CRISPR/Cas9是广泛关注的新一代基因编辑工具,自从2012年被发明以来,它一直以其高效性和特异性备受世人的期待,然而值得注意的是,CRISPR/Cas9从问世以来,其脱靶风险一直备受关注,如果将CRISPR/Cas9及其衍生工具用于临床的话,脱靶效应可能会引起包括癌症在内的很多种副作用。


在此之前,人们推出过多种检测脱靶的方案。以前的方法或者依赖于计算机软件预测,或者依赖于高通量测序检测DSB产生,还有体外检测的方法。这些方法都存在一些局限性,不能高灵敏性检测到脱靶突变,尤其是单核苷酸突变。因此一种能够突破之前限制的脱靶检测技术,将会成为CRISPR/Cas9及其衍生工具是否能最终走上临床的关键。人们迫切希望可以找到一种既能够不依赖于脱靶位点预测,又能有足够信噪比的精密脱靶检测手段。


如果要提升检测脱靶效应的精度,就必须彻底颠覆原有的脱靶检测手段。首先,为了实现不借助于脱靶位点预测,这就要求必须找到非常严格的对照组来确定基因突变的位点;同时为了检测不依赖于sgRNA的随机突变,最好使用基于单细胞全基因组测序。


为了实现以上目标,杨辉研究组与合作者建立了一种名叫“GOTI”的脱靶检测技术。研究者们在小鼠受精卵分裂到二细胞期的时候,编辑一个卵裂球,并使用红色荧光蛋白将其标记。小鼠胚胎发育到14.5天时,将整个小鼠胚胎消化成为单细胞,利用流式细胞分选技术基于红色荧光蛋白,分选出基因编辑细胞和没有基因编辑细胞,再进行全基因组测序比较两组差异。这样就避免了单细胞体外扩增带来的噪音问题。而且由于实验组和对照组来自同一枚受精卵,理论上基因背景完全一致,因此直接比对两组细胞的基因组,其中的差异基本就可以认为是基因编辑工具造成的。


在杨辉实验室全体成员与合作单位的共同努力下,GOTI系统被成功建立了起来。团队成员先用该系统检测了最经典的CRISPR/Cas9系统,发现设计良好的CRISPR/Cas9并没有明显的脱靶效应,这个结果结束了之前对于CRISPR/Cas9脱靶率的争议。


团队还检测了另一个同样被给予厚望的CRISPR/Cas9衍生技术BE3,这个系统可以精确引入点突变,在之前的研究中从未发现过有明显的脱靶问题。然而在GOTI的检测下发现,BE3存在非常严重的脱靶,而且这些脱靶大多出现在传统脱靶预测认为不太可能出现脱靶的位点,因此之前方法一直没有发现其脱靶问题。


团队分析后认为,这些脱靶位点有部分出现在抑癌基因上,因此经典版本的BE3有着很大的隐患,目前不适合作为临床技术。研究团队的这些重要发现,证实了以BE3为代表的部分基因编辑技术存在无法预测的脱靶风险,也世人重新审视了这些新兴技术的风险。


更重要的是,此工作建立了一种在精度、广度和准确性上远超越之前的基因编辑脱靶检测技术,有望由此开发精度更高、安全性更大的新一代基因编辑工具,建立行业的新标准。


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基于CRISPR/Cas9的DNA单碱基编辑技术可以在不切断DNA双链的情况下实现靶向的核苷酸定向突变,在2016年首次在Nature杂志上报道以来受到了广泛的关注,该技术在未来的遗传病治疗中被寄予厚望。后续的多篇研究证明了单碱基编辑系统在小鼠和人的胚胎中具有非常高的编辑效率,同时多篇发表在Nature Medicine的文章证明DNA单碱基编辑技术还可以应用到小鼠的成体治疗中,获得喜人的治疗效果。

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